Vergelijkende evaluatie van DNA-extractiekit, matrixmonster en qPCR-testen voor bewaking van runderbabesiose.

Boviene babesiose veroorzaakt door protozoaire parasieten Babesia bovis en B. bigemina is een van de belangrijkste oorzaken van verliezen voor de vee-industrie in tropische en subtropische gebieden van de wereld. Daarom zijn zeer gevoelige en specifieke instrumenten voor de detectie en monitoring van deze hemoparasieten vereist, vooral bij dragende dieren, waarin meestal lage parasietniveaus aanwezig waren.

In deze context zijn de qPCR-assays de afgelopen jaren met succes en eerlijk gebruikt. Met het oog op het verbeteren van de prestatie van Babesia-niveauscontrole door qPCR, werden enkele van de belangrijkste aspecten van deze methodologie die de resultaten kunnen beïnvloeden getest: DNA-extractiekits, EDTA-voorbehandeling in vol bloed, bloedbron (punt van de staart of halsader), isolatie van erytrocyten , FTA-kaartinterferentie en qPCR-detectiesysteem. Onder onze experimentele omstandigheden hebben zowel EDTA-voorbehandeling als FTA-kaarttoepassing geen invloed op de detectiegevoeligheid, en twee DNA-extractiekits boden een hogere gevoeligheid in vergelijking met andere. Zoals verwacht vertoonden bloedmonsters verzameld uit de punt van staartvaten hogere niveaus van B. bovis-DNA in vergelijking met die verkregen uit de halsader, en erytrocyten die geïsoleerd werden verwerkt, hebben ook de gevoeligheid verbeterd in vergelijking met volbloed.

Bovendien vertoonden beide qPCR-assays die hier zijn ontwikkeld met behulp van hydrolyse-sondes voor B. bovis- en B. bigemina-detectie, verbeterde reproduceerbaarheid in vergelijking met qPCR-assays met behulp van intercalerend kleurstofsysteem. Zelfs qPCR voor B. bigemina met behulp van de hier ontwikkelde hydrolyse-sonde vertoonde een hogere gevoeligheid in vergelijking met het intercalerende kleurstofsysteem. Deze studie heeft bijgedragen tot de verbetering van de moleculaire diagnose van boviene babesiose, wat epidemiologische studies met betrekking tot deze pathogenen kan verbeteren.

Evaluatie van Simplexa Group A Strep Direct Kit vergeleken met Hologic Group A Streptococcen Direct Assay voor detectie van Groep A Streptococcus in keeluitstrijkjes.

De diagnose van bacteriële faryngitis wordt bevestigd door detectie van groep A Streptococcus (GAS) in keelmonsters van patiënten. Het testen van keelmonsters is van oudsher gebaseerd op kweek, maar nieuwe moleculaire methoden maken een veel snellere testdoorlooptijd mogelijk (d.w.z. dezelfde dag versus 48 tot 72 uur voor kweek). Ons laboratorium gebruikt de Hologic GAS Direct (GASD) -test voor het screenen van meer dan 125.000 keelmonsters per jaar.

Simplexa GAS Direct is een nieuwe real-time kwantitatieve PCR (qPCR) -test waarvoor geen initiële DNA-extractie nodig is. De prestaties van Simplexa qPCR werden vergeleken met GASD. In totaal werden 289 keeluitstrijkjes verzameld van patiënten die ambulante klinieken bezochten in Calgary, Alberta, Canada. In totaal waren 60 (20,8%) van de monsters aanvankelijk GAS-positief met beide methoden: 54 met beide methoden, 4 met Simplex qPCR alleen en 2 met GASD alleen.

Een interne PCR met behulp van een unieke GAS-primerset werd gebruikt om de 6 discrepante resultaten op te lossen. Over het algemeen had GASD in vergelijking met Simplexa qPCR een gevoeligheid, specificiteit, positief voorspellende waarde en negatief voorspellende waarde van respectievelijk 93,1% versus 100%, 100% versus 100%, 100% versus 100% en 98,31% versus 100%. Implementatie van Simplexa qPCR in onze laboratoriumomgeving zou meer kosten, maar zou het mogelijk maken om het hoge monstervolume in de helft van de tijd te rapporteren en 0,62 fulltime equivalent (FTE) voor medisch laboratoriumtechnici (MLT) te besparen. In vergelijking met cultuur zou de implementatie van Simplexa qPCR 2,79 FTE voor medisch laboratoriumassistent (MLA) plus 0,94 MLT FTE besparen. Simplexa qPCR heeft de prestaties en diagnostische efficiëntie in een laboratorium met grote volumes verbeterd in vergelijking met GASD voor GAS-detectie in keelzwabbers.

PCR selecteren voor de diagnose van intestinale parasitose: keuze van doelen, evaluatie van interne tests en vergelijking met commerciële kits.

Microscopie van ontlastingsmonsters is een arbeidsintensieve en onnauwkeurige techniek voor het opsporen van darmparasieten die diarree veroorzaken en vervanging door PCR is aantrekkelijk. Bijna alle gevallen van diarree veroorzaakt door parasieten gedurende een periode van negen jaar in ons laboratorium waren te wijten aan Giardia lamblia, Cryptosporidium-soorten of Entamoeba histolytica, gedetecteerd door microscopie.

We evalueerden en selecteerden in-house singleplex real-time PCR (RT-PCR) -testen voor deze pathogenen in 99 ontlastingsmonsters van patiënten waarvan werd vermoed dat ze darmparasitose hadden, getest met microscopie. De strategie omvatte een geslachtspecifieke PCR-test voor C. parvum en C. hominis, met daaropvolgende identificatie door een PCR die onderscheid maakt tussen de twee soorten.

G. lamblia werd gedetecteerd in vijf en C. parvum in één van de 68 microscopie-negatieve monsters. De prestaties van de interne RT-PCR-assays werden vergeleken met drie in de handel verkrijgbare multiplex test (MT-PCR) kit-systemen in 81 ontlastingsmonsters, verzameld in 28 microscopie-positieve en 27 microscopie-negatieve monsters van individuen die verdacht werden van darmparasitose en in 26 monsters van individuen zonder verdenking van parasitaire infectie. De interne testen detecteerden parasieten in meer monsters van patiënten waarvan werd vermoed dat ze parasitose hadden dan bij alle kits. We concluderen dat commerciële kits zich richten op relevante parasieten, maar hun prestaties kunnen variëren.

Ontwikkelingsvalidatie van GlobalFiler ™ PCR-amplificatiekit: een 6-kleurstof multiplex-assay ontworpen voor amplificatie van casusmonsters.

De GlobalFiler ™ PCR-versterkingskit is een enkele multiplex-assay die een set van 24 markers amplificeert, die de European Standard Set en de door CODIS (Combined DNA Index System) aanbevolen samengestelde set van loci omvat. Naast meer loci en een chemieformaat met 6 kleurstoffen, is de Master Mix geformuleerd om een ​​hoger laadvolume van monsters voor sporen-DNA-monsters mogelijk te maken. De GlobalFiler ™ -kit is geoptimaliseerd om hoge prestaties te leveren op casusmonsters en tegelijkertijd een snelle thermische cyclus te leveren, met een versterkingstijd van ongeveer 80 minuten.

Poly-Caspase Assay Kit
20-abx299016	Abbexa	EUR 1302.00 EUR 582.00	100 tests 25 tests

Caspase 6 Assay Kit
20-abx299018	Abbexa	EUR 1302.00 EUR 582.00	100 tests 25 tests

Caspase 8 Assay Kit
20-abx299020	Abbexa	EUR 1302.00 EUR 582.00	100 tests 25 tests

Caspase 9 Assay Kit
20-abx299021	Abbexa	EUR 1302.00 EUR 582.00	100 tests 25 tests

Poly-Caspase Assay Kit
abx299022-2550tests	Abbexa	25-50 tests	EUR 692

Poly-Caspase Assay Kit
20-abx299025	Abbexa	EUR 1302.00 EUR 582.00	100 tests 25 tests

Caspase 2 Assay Kit
abx299026-25tests	Abbexa	25 tests	EUR 582

Caspase 10 Assay Kit
abx299027-100tests	Abbexa	100 tests	EUR 1302

Caspase 9 Assay Kit
20-abx299035	Abbexa	EUR 1302.00 EUR 582.00	100 tests 25 tests

Caspase 12 Assay Kit
55R-1290	Fitzgerald	25 assays	EUR 328
Description: Assay Kit for detection of Capase 12 activity in the research laboratory

FAM-Phe-CMK FLISP™ Assay Kit
KF17314	Neuromics	25 Tests	EUR 291

FAM-Phe-CMK FLISP™ Assay Kit
KF17315	Neuromics	100 Tests	EUR 695

FAM-Lue-CMK FLISP™ Assay Kit
KF17316	Neuromics	25 Tests	EUR 291

FAM-Leu-CMK FLISP™ Assay Kit
KF17317	Neuromics	100 Tests	EUR 695

FAM-Phe-CMK Serine Protease Assay Kit
abx299010-25tests	Abbexa	25 tests	EUR 566

FAM-Leu-CMK Serine Protease Assay Kit
abx299011-25tests	Abbexa	25 tests	EUR 566

FAM-Leu-DAP Serine Protease Assay Kit
abx299012-25tests	Abbexa	25 tests	EUR 566

FAM-Phe-DAP Serine Protease Assay Kit
abx299013-25tests	Abbexa	25 tests	EUR 582

Glycerol Cell-Based Assay Kit
K977-100	Biovision		EUR 490

Caspase-8 IETD-R110 Fluorometric and Colorimetric Assay Kit (25 assays)
30011-1	Biotium	1KIT	EUR 204
Description: Minimum order quantity: 1 unit of 1KIT

Caspase 1 Colorimetric Cell-Based ELISA Kit
EKC1083	BosterBio	100ul	EUR 572

Caspase 2 Assay Kit, green
KF17202	Neuromics	25 Tests	EUR 304

Caspase 6 Assay Kit, green
KF17204	Neuromics	25 Tests	EUR 304

Caspase 8 Assay Kit, green
KF17205	Neuromics	25 Tests	EUR 304

Caspase 9 Assay Kit, green
KF17206	Neuromics	25 Tests	EUR 304

Caspase 10 Assay Kit, green
KF17207	Neuromics	25 Tests	EUR 304

Caspase 13 Assay Kit, green
KF17208	Neuromics	25 Tests	EUR 304

Caspase 9 Assay Kit, red
KF17302	Neuromics	25 Tests	EUR 304

Caspase-2 Activity Assay Kit
AR4004-100Assays	BosterBio	100 Assays	EUR 514

Caspase-2 Activity Assay Kit
AR4004-25Assays	BosterBio	25 Assays	EUR 236

Caspase-2 Activity Assay Kit
AR4004-50Assays	BosterBio	50 Assays	EUR 340

Caspase 3/7 Assay Kit
20-abx299017	Abbexa	EUR 1302.00 EUR 582.00	100 tests 25 tests

Caspase 3/7 Assay Kit
abx299024-2550tests	Abbexa	25-50 tests	EUR 692

Caspase 3/7 Assay Kit
20-abx299028	Abbexa	EUR 1193.00 EUR 582.00	100 tests 25 tests

Caspase-3 Fluorometric Assay Kit
K2007-200	ApexBio	200 assays	EUR 696

Caspase-3 Fluorometric Assay Kit
K2007-25	ApexBio	25 assays	EUR 238

Caspase-3 Fluorometric Assay Kit
K2007-400	ApexBio	400 assays	EUR 1086

Caspase-3 Colorimetric Assay Kit
K2008-200	ApexBio	200 assays	EUR 696

Caspase-3 Colorimetric Assay Kit
K2008-25	ApexBio	25 assays	EUR 238

Caspase-3 Colorimetric Assay Kit
K2008-400	ApexBio	400 assays	EUR 1086

Caspase-8 Fluorometric Assay Kit
K2012-200	ApexBio	200 assays	EUR 696

Caspase-8 Fluorometric Assay Kit
K2012-25	ApexBio	25 assays	EUR 238

Caspase-8 Fluorometric Assay Kit
K2012-400	ApexBio	400 assays	EUR 1086

Caspase-8 Colorimetric Assay Kit
K2013-200	ApexBio	200 assays	EUR 696

Caspase-8 Colorimetric Assay Kit
K2013-25	ApexBio	25 assays	EUR 238

Caspase-8 Colorimetric Assay Kit
K2013-400	ApexBio	400 assays	EUR 1086

Caspase-6 Fluorometric Assay Kit
K2014-200	ApexBio	200 assays	EUR 696

Caspase-6 Fluorometric Assay Kit
K2014-25	ApexBio	25 assays	EUR 238

Caspase-6 Fluorometric Assay Kit
K2014-400	ApexBio	400 assays	EUR 1086

Caspase-6 Colorimetric Assay Kit
K2015-200	ApexBio	200 assays	EUR 696

Caspase-6 Colorimetric Assay Kit
K2015-25	ApexBio	25 assays	EUR 238

Caspase-6 Colorimetric Assay Kit
K2015-400	ApexBio	400 assays	EUR 1101

Caspase-2 Fluorometric Assay Kit
K2016-200	ApexBio	200 assays	EUR 696

Caspase-2 Fluorometric Assay Kit
K2016-25	ApexBio	25 assays	EUR 238

Caspase-2 Fluorometric Assay Kit
K2016-400	ApexBio	400 assays	EUR 1114

Caspase-2 Colorimetric Assay Kit
K2017-200	ApexBio	200 assays	EUR 725

Caspase-2 Colorimetric Assay Kit
K2017-25	ApexBio	25 assays	EUR 251

Caspase-2 Colorimetric Assay Kit
K2017-400	ApexBio	400 assays	EUR 1156

Caspase-9 Fluorometric Assay Kit
K2018-200	ApexBio	200 assays	EUR 669

Caspase-9 Fluorometric Assay Kit
K2018-25	ApexBio	25 assays	EUR 238

Hier rapporteren we de resultaten van de ontwikkelingsvalidatiestudie die de SWGDAM-richtlijnen (Scientific Working Group on DNA Analysis Methods) volgde en gegevens bevat voor PCR-gebaseerde studies, gevoeligheid, soortspecificiteit, stabiliteit, precisie, reproduceerbaarheid en herhaalbaarheid, concordantie, stotteren , DNA-mengsels en prestaties op mock casework-monsters. De resultaten valideren het multiplex-ontwerp en demonstreren de robuustheid, betrouwbaarheid en geschiktheid van de kit als een test voor menselijke identificatie met DNA-monsters van de behuizing.